一、背景

機(jī)械負(fù)荷是工程心血管組織中組織特性的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑。為了最終調(diào)節(jié)生化過程，必須量化機(jī)械負(fù)荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機(jī)硅層中，以允許心血管工程結(jié)構(gòu)的長期單軸循環(huán)機(jī)械應(yīng)變。與未應(yīng)變構(gòu)建體相比，這些構(gòu)建體承受了兩種不同的應(yīng)變量級，并且在生化性能、力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面表現(xiàn)出差異。結(jié)果表明，當(dāng)組織暴露于長時間的機(jī)械刺激時，會誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)比例的膠原蛋白的產(chǎn)生。然而，以大應(yīng)變大小的應(yīng)變對組織的機(jī)械性能產(chǎn)生負(fù)面影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，動態(tài)應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列。所提出的模型系統(tǒng)可用于系統(tǒng)地優(yōu)化工程心血管組織的培養(yǎng)方案。

機(jī)械調(diào)節(jié)對細(xì)胞生物合成活性的影響已經(jīng)在二維和三維培養(yǎng)條件下進(jìn)行了研究，并且這種效果取決于ECM的性質(zhì)。 通過使用各種培養(yǎng)系統(tǒng)（例如縱向拉伸裝置和真空驅(qū)動裝置）刺激細(xì)胞。 已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，著眼于機(jī)械刺激對復(fù)雜幾何形狀的組織重塑的影響。在定義明確的簡單幾何中進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。 塞利克塔等培養(yǎng)的。成纖維細(xì)胞填充的膠原凝膠（管狀構(gòu)建體）在存在下精確控制變形。只有有限數(shù)量的研究集中在明確定義的機(jī)械負(fù)荷對工程心血管組織特性的影響，其中研究了ECM的從頭形成（例如，用細(xì)胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）。需要對工程結(jié)構(gòu)中的組織特性進(jìn)行機(jī)械控制。這需要詳細(xì)研究明確定義的加載條件對ECM合成和ECM組織的影響，以優(yōu)化加載方案。

二、材料和方法

細(xì)胞和組織培養(yǎng)

人隱靜脈細(xì)胞（HSVC，肌成纖維細(xì)胞）取自一名44歲的女性，并使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法生長。44細(xì)胞在由先進(jìn)的Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素。

將支架真空干燥48小時，然后暴露于紫外線下1小時，隨后置于70%乙醇中4-5小時以獲得無菌。讓支架干燥過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水。在細(xì)胞接種之前，將組織培養(yǎng)基加入支架中16小時以促進(jìn)細(xì)胞附著。使用纖維蛋白凝膠作為細(xì)胞載體，將第7代的HSVC細(xì)胞接種在這些支架上。細(xì)胞以每厘米約20萬個細(xì)胞的濃度接種隨后將組織構(gòu)建體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)（在37°C和5%CO2).組織培養(yǎng)基每3-4天更換一次，由補(bǔ)充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸。

應(yīng)變拉伸

將工程心血管構(gòu)建體培養(yǎng)3周，包括6天無施加負(fù)荷以使細(xì)胞在接種后適應(yīng)，然后以2 Hz的頻率進(jìn)行1周的動態(tài)應(yīng)變。應(yīng)用三種不同的應(yīng)變條件：0%應(yīng)變，4%動態(tài)應(yīng)變和8%動態(tài)應(yīng)變（n = 8）。在以4%和8%應(yīng)變的單獨(dú)樣品上進(jìn)行所施加應(yīng)變的測量2周和3周（n = 6）。

機(jī)械測試

培養(yǎng)3周后犧牲構(gòu)建體，并在1小時內(nèi)測試其機(jī)械性能（n = 6）。從樣品中除去有機(jī)硅層，并將剩余的組織置于組織培養(yǎng)基中以滋潤樣品。樣品的厚度和寬度使用以下命令測定 Plμ 2300 非接觸式光學(xué)圖像輪廓儀。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進(jìn)行掃描。通過對代表性區(qū)域求平均值來獲得厚度和寬度。

組織形成的生化測定

三、結(jié)果

循環(huán)應(yīng)變對組織性質(zhì)的影響

表征不同應(yīng)變大小對工程心血管組織特性、構(gòu)建體的切線剛度以及 DNA、GAG、膠原蛋白和 HP 交聯(lián)量的影響（表1）被量化。相對于未應(yīng)變的工程組織構(gòu)建體，循環(huán)菌株不會增加工程組織構(gòu)建體中每干重的DNA量。然而，與未過濾的組織結(jié)構(gòu)相比，機(jī)械應(yīng)變結(jié)構(gòu)體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低。另一方面，在兩種應(yīng)變條件下，每個三螺旋的HP交聯(lián)數(shù)量顯著增加。4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的切線剛度等于未應(yīng)變組織結(jié)構(gòu)的剛度，而8%應(yīng)變結(jié)構(gòu)相對于未應(yīng)變結(jié)構(gòu)和4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的剛度均顯著降低（圖）。4).

細(xì)胞拉伸

圖4

3周齡工程心血管結(jié)構(gòu)的切線剛度（MPa）作為不同應(yīng)變大小的函數(shù)。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05） 的顯著差異，表示與 4% 加載條件 （p < 0.05） 的顯著差異++

四、討論

機(jī)械負(fù)荷是活組織內(nèi)生化過程的重要調(diào)節(jié)器。為了調(diào)節(jié)這些生化過程，必須量化機(jī)械負(fù)荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。在這項(xiàng)研究中，提出了一個實(shí)驗(yàn)框架，其中使用應(yīng)變系統(tǒng)的改編版本在一次實(shí)驗(yàn)中同時對單個樣品施加各種應(yīng)變量級。系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高通量的樣品，并且易于長時間保持無菌狀態(tài)。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機(jī)硅層中，允許這些結(jié)構(gòu)的重復(fù)和單軸長期機(jī)械應(yīng)變。這些構(gòu)建物附著在Bioflex孔（美國Flexcell Int. Corp.）上，經(jīng)受兩種不同的應(yīng)變量級數(shù)周，與未應(yīng)變的構(gòu)建物相比，在生化性能、機(jī)械性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面顯示出差異。結(jié)果表明，長時間的機(jī)械刺激誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)分?jǐn)?shù)的膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善了膠原蛋白的內(nèi)在機(jī)械性能。然而，過大的應(yīng)變導(dǎo)致應(yīng)變對組織的機(jī)械性能產(chǎn)生不利影響。此外，與構(gòu)建體的深層相比，應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列。

為了能夠拉伸三維工程心血管結(jié)構(gòu)，模型系統(tǒng)得到了進(jìn)一步發(fā)展。組織結(jié)構(gòu)的組成部分之一是涂有P4HB的PGA，以前沒有表現(xiàn)出彈性材料行為。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態(tài)硅膠中。這允許對這些工程組織進(jìn)行動態(tài)拉伸。在培養(yǎng)2周（1周菌株）后驗(yàn)證應(yīng)變場，支撐有機(jī)硅層的存在導(dǎo)致工程結(jié)構(gòu)的彈性響應(yīng)，這可以通過在培養(yǎng)2周后保留最初施加的應(yīng)變的事實(shí)來說明。然而，3周后的應(yīng)變分布無法確定為結(jié)構(gòu)與支撐有機(jī)硅層部分分離，這大約對應(yīng)于PGA機(jī)械完整性的損失。 雖然應(yīng)變沒有確定，但動態(tài)成分仍然存在。這意味著受控應(yīng)變最終可以在 2.5-3 周的時間內(nèi)應(yīng)用。對不同應(yīng)變場的分析表明，平均應(yīng)變構(gòu)成了所施加的應(yīng)變，對無組織構(gòu)建的膜進(jìn)行了驗(yàn)證。然而，組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)變分布更加不均勻?？赡埽痪鶆虻淖冃慰梢詺w因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性。設(shè)置的限制是組織形成（圖。5A-C）由于有機(jī)硅層存在下營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少而收縮到結(jié)構(gòu)表面。

在本研究中，動態(tài)應(yīng)變對增殖沒有影響。動態(tài)菌株和未菌株構(gòu)建體之間每干重的DNA量沒有差異。以前，在相對長期的研究中，細(xì)胞增殖不受機(jī)械負(fù)荷的影響。2，28，38 然而，Mol等人。38確實(shí)顯示出自由浮動工程心血管結(jié)構(gòu)的增殖水平升高，這些結(jié)構(gòu)不受機(jī)械約束。必須認(rèn)識到，在這項(xiàng)研究中，未應(yīng)變的結(jié)構(gòu)并非沒有壓力。HSVC屬于肌成纖維細(xì)胞表型25，38，這些肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生連續(xù)的等長張力。24 由于工程結(jié)構(gòu)被支撐硅膠層限制為收縮，因此在結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生了內(nèi)部張力。（肌）成纖維細(xì)胞收縮產(chǎn)生的內(nèi)部應(yīng)力足以限制細(xì)胞增殖。

體內(nèi)活細(xì)胞存在于動態(tài)的生理環(huán)境中，受到廣泛的機(jī)械刺激，包括拉伸、壓縮、剪切應(yīng)力和流體靜壓力等。然而在一般的體外培養(yǎng)和分析條件下，細(xì)胞沒有受到來自生長環(huán)境的力學(xué)刺激。通過國產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀，可以提供與體內(nèi)細(xì)胞相似的生理環(huán)境，幫助研究人員分析各種細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的拉伸負(fù)荷的生化變化，包括肌肉、肺、心臟、血管、皮膚等。

詳情介紹

國產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力加載系統(tǒng)

CELL TANK

國產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)

技術(shù)背景：

當(dāng)前細(xì)胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實(shí)際“動態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化、細(xì)胞間相互作用與體內(nèi)動態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)以及基因蛋白表達(dá)改變等。

細(xì)胞牽張系統(tǒng)將帶來跨領(lǐng)域的創(chuàng)新：

●動物實(shí)驗(yàn)前更可靠的評估

細(xì)胞拉伸儀腔體

●干細(xì)胞分化機(jī)制

●機(jī)械刺激力與癌癥的相關(guān)性

●生醫(yī)材料與細(xì)胞動態(tài)特性研究

●體外疾病微環(huán)境的快速建立

CellTank一體式細(xì)胞牽張拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)

CELL TANK為細(xì)胞和組織模型提供機(jī)械拉伸條件的平臺。

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CELL TANK為細(xì)胞牽張系統(tǒng)使科學(xué)家能夠輕松而精確地將仿生機(jī)械應(yīng)變應(yīng)用于細(xì)胞和組織。

國產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀

預(yù)埋橫桿式培養(yǎng)腔室

拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm

拉伸腔體

可視化圖形操作界面

細(xì)胞拉伸儀界面

細(xì)胞拉伸儀界面

HOW TO USE

1. 細(xì)胞外基質(zhì)涂層進(jìn)行預(yù)處理，將細(xì)胞接種到腔室中，細(xì)胞粘附在基底上，開始過夜培養(yǎng)過程。

2. 細(xì)胞增殖后，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。

3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)收獲/處理細(xì)胞，分析數(shù)據(jù)。

優(yōu)勢

· 均勻負(fù)載

培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù)，保證每個細(xì)胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變，非軸向方向上的次級載荷極低

· 高再現(xiàn)性

高精度步進(jìn)電機(jī)保證在各種速度和拉伸比組合中實(shí)現(xiàn)一致的運(yùn)動程序，機(jī)械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激

· 一體式控制

自帶觸摸控制屏，無需電腦。內(nèi)置ARM芯片，高效穩(wěn)定運(yùn)行的同時簡單易用

· 多樣的拉伸模式

靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形

· 高通量培養(yǎng)腔室

有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)，包括細(xì)胞固定和熒光成像等

設(shè)備參數(shù)

外形尺寸 350x330x110 mm主機(jī)重量 3 kg拉伸腔體 4個，32x32 mm / 8個，20x20 mm控制模式 三角波、正弦波、方波及其組合最大應(yīng)變率 30%最高拉伸速率 30 mm/s最高循環(huán)頻率 2 Hz基底膜厚度 0.2 mm使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱

橫桿拉伸技術(shù)局部應(yīng)變率更均勻

拉伸腔有限元分析

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